测量绿色植物组织或器官中叶绿素含量的方法
来源： http://www.grainyq.com/ 类别：实用技术 更新时间：2013-05-14 阅读次
【本资讯由中国粮油仪器网提供】 测量绿色植物组织或器官中叶绿素含量的原理：根据叶绿家对可见光的吸收光谱，利用分光光度计在某一特定波长下测定其吸光度，而后公式计算叶绿素含量。
根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光皮A应与其浓度c和液层厚度L成比例，即：
A＝KCL
式中lx为比例常数，当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，K为该物质的比吸收系数。各种有色物质溶液在不同波长下的比吸收系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长的吸光值而求得。
如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。如欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b、叶黄素、胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在3个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的比吸收系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时，为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光应选择叶绿索在红光区的最大吸收峰。
仪器设备：1.分光光度计：1台；叶绿素检测仪：1台。2.研钵：1台.3.员简：1个。4.剪刀：1把。5.50mL量瓶：1个。6.玻璃棒。7.1cm漏斗：1个。8.7cm滤纸：1张。9.滴管：1支。试剂：80％丙酮。材料：任何绿色植物组织或器官。
测量绿色植物组织或器官中叶绿素含量的方法步骤：
（一）研磨法玻璃棒。
7cm滤纸：1张。
1.取样、剪碎、混匀，然后称取新鲜样品1.18g。
2.样品置研钵中，加少量CaC03和石英砂及0.5mL纯丙酮研成匀浆，再加80％丙酮10mL继续研磨至组织变为白色。
3.取滤纸一张，放入漏斗中用80％丙酮湿润，把提取液倒入漏斗中，滤入25mL量瓶里，用少量丙酮冲洗研体数次，最后连残渣起倒人漏斗。
4.用滴管吸取80％丙酮，一滴一滴的将滤纸上的叫绿家提取液全部洗入量瓶内，直到滤纸和残渣中无绿色为止。最后用80％丙酮定容至25mL。
5.把叶绿体色素提取液倒人光径1cm的比色杯内，分光光度计分别在波长645nm、663nm和652nm下测定吸光度，以80％丙酮为空白对照，并于叶绿素检测仪的测量值进行对比分析。
6.分别计算叶绿素)a、b)和叶绿素的总浓度(mg/L)，若用96％乙醇，需在波长665nm、649nm和470nm下测定吸光度，则计算叶绿素a、b和类胡萝卜素含量，相加即得叶绿素总浓度。
7.求得色素浓度后冉按下式计算组织中各色家含量(用mg•g“鲜重或干重表水)式中，C：叶绿体色素的浓度(mg/L)小w：鲜重(g)lv：提取液总体积(ml)；稀释倍数。
（二）直接浸提法
1.将新鲜小麦M1片剪成0.2cm左方的细丝或小块混合均匀后.称取0.10—0.20825mL容量瓶或具塞刻度试管中。
2在容量瓶或试管中加入0.5mL纯丙酮和10—15mL80％的丙酮，并仔细将就附在瓶壁边缘的叶片碎末洗到丙酮溶液中去，盖上瓶塞，室温下置暗处浸提过夜4其间摇动3—4次。
3.次日取出容量瓶，观察nl组织巳全部交白时，表示叶绿素已浸提干净，然后用80％丙酮定容至25mL刻度，过滤或离心后，与研磨法同样进行比色测定。
（三）注意事项：
1.为了避免叶绿素的光分解，操作应在弱光进行。并尽可能缩短研磨时间2min为宜。
2.克接浸提法也可采用丙酮一乙醇—水混合液，其配制比例为：纯丙酮：无水乙醇：蒸馏水。
3.若是干材料，可经研磨过筛后，称取0.10g左右、与鲜样同法浸提(但不用加0.5mL纯丙酮)。
4.用分光光度法测定叶绿体色素含量，对分光光度计本身的精确性要求较高，分光光度计在使用前需对波长进行校正。校正的方法除按仪器说明校正外，还应以纯的叶绿素a和b来校正。因为即使用国产仪器中性能较好的7200型分光光度计，经校正后在660-700nm波段中的读数误差还可能有12nm，这对测定叶绿索a，b值已有影响，具体校正步骤可参照参文献中的方法进行。
根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光皮A应与其浓度c和液层厚度L成比例，即：
A＝KCL
式中lx为比例常数，当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，K为该物质的比吸收系数。各种有色物质溶液在不同波长下的比吸收系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长的吸光值而求得。
如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。如欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b、叶黄素、胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在3个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的比吸收系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时，为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光应选择叶绿索在红光区的最大吸收峰。
仪器设备：1.分光光度计：1台；叶绿素检测仪：1台。2.研钵：1台.3.员简：1个。4.剪刀：1把。5.50mL量瓶：1个。6.玻璃棒。7.1cm漏斗：1个。8.7cm滤纸：1张。9.滴管：1支。试剂：80％丙酮。材料：任何绿色植物组织或器官。
测量绿色植物组织或器官中叶绿素含量的方法步骤：
（一）研磨法玻璃棒。
7cm滤纸：1张。
1.取样、剪碎、混匀，然后称取新鲜样品1.18g。
2.样品置研钵中，加少量CaC03和石英砂及0.5mL纯丙酮研成匀浆，再加80％丙酮10mL继续研磨至组织变为白色。
3.取滤纸一张，放入漏斗中用80％丙酮湿润，把提取液倒入漏斗中，滤入25mL量瓶里，用少量丙酮冲洗研体数次，最后连残渣起倒人漏斗。
4.用滴管吸取80％丙酮，一滴一滴的将滤纸上的叫绿家提取液全部洗入量瓶内，直到滤纸和残渣中无绿色为止。最后用80％丙酮定容至25mL。
5.把叶绿体色素提取液倒人光径1cm的比色杯内，分光光度计分别在波长645nm、663nm和652nm下测定吸光度，以80％丙酮为空白对照，并于叶绿素检测仪的测量值进行对比分析。
6.分别计算叶绿素)a、b)和叶绿素的总浓度(mg/L)，若用96％乙醇，需在波长665nm、649nm和470nm下测定吸光度，则计算叶绿素a、b和类胡萝卜素含量，相加即得叶绿素总浓度。
7.求得色素浓度后冉按下式计算组织中各色家含量(用mg•g“鲜重或干重表水)式中，C：叶绿体色素的浓度(mg/L)小w：鲜重(g)lv：提取液总体积(ml)；稀释倍数。
（二）直接浸提法
1.将新鲜小麦M1片剪成0.2cm左方的细丝或小块混合均匀后.称取0.10—0.20825mL容量瓶或具塞刻度试管中。
2在容量瓶或试管中加入0.5mL纯丙酮和10—15mL80％的丙酮，并仔细将就附在瓶壁边缘的叶片碎末洗到丙酮溶液中去，盖上瓶塞，室温下置暗处浸提过夜4其间摇动3—4次。
3.次日取出容量瓶，观察nl组织巳全部交白时，表示叶绿素已浸提干净，然后用80％丙酮定容至25mL刻度，过滤或离心后，与研磨法同样进行比色测定。
（三）注意事项：
1.为了避免叶绿素的光分解，操作应在弱光进行。并尽可能缩短研磨时间2min为宜。
2.克接浸提法也可采用丙酮一乙醇—水混合液，其配制比例为：纯丙酮：无水乙醇：蒸馏水。
3.若是干材料，可经研磨过筛后，称取0.10g左右、与鲜样同法浸提(但不用加0.5mL纯丙酮)。
4.用分光光度法测定叶绿体色素含量，对分光光度计本身的精确性要求较高，分光光度计在使用前需对波长进行校正。校正的方法除按仪器说明校正外，还应以纯的叶绿素a和b来校正。因为即使用国产仪器中性能较好的7200型分光光度计，经校正后在660-700nm波段中的读数误差还可能有12nm，这对测定叶绿索a，b值已有影响，具体校正步骤可参照参文献中的方法进行。
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