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几种蛋白质含量测量方法比较

来源: 本站  类别:实用技术  更新时间:2010-08-31  阅读
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几种蛋白质含量测量方法比较
蛋白质含量测定一直是生物化学中最常用、最基本的分析方法之一。蛋白质是生命的物质基础,没有蛋白质就没有生命。机体每个系统都有蛋白质的参与,蛋白质占人体重量的16.3%。人体的蛋白质主要来源于食物:豆制品、肉类或者奶粉等副食品。既然蛋白质都来自于食物,那么测定食物中的蛋白质含量就变得很有必要。
蛋白质含量测定有好多种方法,归纳起来为:凯氏定氮法、双缩尿法、Folin酚试剂法、紫外吸收法和考马斯亮蓝法。不同的方法,原理、步骤和实验试剂都各不相同,但是一直以来,凯氏定氮法最为经典,使用最为广泛。近几年,根据蛋白质测定的凯氏定氮法,很多厂家已研制出了相应的仪器,如:蛋白质测定仪。蛋白质测定仪测出的蛋白质含量,包括其他非蛋白含氮化合物,如游离氨基酸、尿素等物质,因此该仪器有时又被叫做粗蛋白测定仪
下面我们列表来对各种蛋白质含量测定方法进行比较。
方法
灵敏度
时间
原理
干扰物质
说明
凯氏定氮法
灵敏度低,使用于0.2-1.0mg氮,误差为±2%
费时,8-10小时,但如果采用凯氏定氮仪,缩短时间至4个小时
将蛋白氮转化为氨气,然后用酸吸收滴定
非蛋白氮(可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离)
用于标准蛋白质含量的准确测定,干扰少,如果采用凯氏定氮仪,就会大大缩短定氮时间
双缩尿法
灵敏度低,1-20mg
中速20-30分钟
多肽键+碱性Cu2+紫色络合物
硫酸铵:Tris缓冲液,某些氨基酸
用于快速测定,但不灵敏,不同蛋白质显色相似
Folin酚试剂法
灵敏度高,<5微克
慢速40-60分钟
双缩尿反应,磷钼酸-磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原
硫酸铵,Tris缓冲液,甘氨酸,各种硫醇
耗费时间长;操作要严格计时;颜色深浅随不同蛋白质变化
紫外吸收法
较为灵敏,50-100微克
快速5-10分钟
蛋白质中的络氨酸和色氨酸残基在280nm处德 光吸收
各种嘌呤和各种核苷酸
用于层析柱流出液的检测,核酸的吸收可以校正
考马斯亮蓝法
灵敏度最高,1-5微克
快速5-15分钟
考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时,其λmax由465nm变为595nm
强碱性缓冲液,TritonX-100SDS
最好的方法,干扰物质少,颜色稳定,颜色深浅随不同蛋白质变化
由上表可知,考马斯亮蓝法和Folin酚试剂法灵敏度最高,比紫外吸收方法高10-20倍。凯氏定氮法虽然比较复杂,但是精确度较高,因此作物蛋白质测定的标准方法,而蛋白质测定仪的发明,更是推动了凯氏定氮法的发展。我们在选择何种方法测定蛋白质含量时,应该根据实际情况,从下面几个点考虑:1.实验堆测定所要求的灵敏度和精确度。2.蛋白质的性质3.溶液中存在的干扰物4.测定时间。从以上四个方面综合考虑,最后选择最合适的测定方法。
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