1 主题内容与适用范围

本标准规定了饲料中有效赖氨酸的测定方法。

本标准适用于含有动物或植物性蛋白质的配合（混合）饲料及单一饲料。

2 引用标准

GB 6432 饲料粗蛋白测定方法

3 术语

有效赖氨酸是指在规定的测定条件下测得的总赖氨酸和非有效赖氨酸之差。

4 原理

蛋白质中有效赖氨酸的ε-氨基可与2，4-二硝基氟苯反应，酸解后生成二硝基苯赖氨酸，而其他非有效部分则生成赖氨酸。因此将不经二硝基氟苯处理的样品和经由二硝基氟苯处理的样品分别水解，用离子交换色谱法测定各自的赖氨酸含量，即可由其差值得出样品中有效赖氨酸的含量。

5 试剂和溶液

本标准所用试剂均为分析纯，水为去离子水。

5.1 乙醚（HG 3—1002）。

5.2 碳酸氢钠（GB 640）溶液：80g/L。

5.3 2.4-二硝基氟苯（DNFB）乙醇溶液：

将一定量的DNFB溶于95％乙醇，其体积比为0.15∶12，该溶液用前现配。

5.4 盐酸（GB 622）溶液：6.0mol/L。

5.5 盐酸（GB 622）溶液：6.5mol/L。

5.6 稀释用柠檬酸钠缓冲液：pH约2.2。

将下列试剂依次溶于适量水：

20g水合柠檬酸（HG 3—1108）

8g氢氧化钠（GB 629）

16mL浓盐酸（GB 622）

0.1mL辛酸

20mL硫二甘醇

加水稀释至1000mL。

5.7 层析用柠檬酸钠缓冲液：

pH值及配制方法依不同型号的氨基酸测定仪有所区别，请参见仪器说明书配制。

5.8 茚三酮试剂

按仪器说明书配制。

5.9 赖氨酸标准液：50nmol/mL或其他浓度。

先配制2.5μmol/mL赖氨酸标准贮备液：称取45.6mg赖氨酸单盐酸盐溶于0.1mol/L的盐酸中，稀释至100mL，混匀。

用该标准贮备液或商品2.5μmol/mL的标准氨基酸混合液，以pH2.2柠檬酸钠缓冲液为溶剂配制50.0nmol/mL标准液。也可根据仪器说明书配制成其他最佳使用浓度。

6 仪器、设备

6.1 实验室用样品粉碎机：能快速一致地粉碎样品并能避免样品过热和尽可能少

6.2 样品筛：孔径0.25mm（60目）。

6.3 分析天平：感量0.0001g。

6.4 油浴：温度可稳定于120～130℃之间。

6.5 回流水解装置：150mL、500mL短颈烧瓶以玻璃磨口接头与回流冷凝器（长约35～40cm）相接。

6.6 离心机：4000r/min。

6.7 旋转蒸发器。

6.8 氨基酸自动分析仪。

6.9 回流水解装置：50mL水解管或消煮管，具磨口接头与回流冷凝器相接。

6.10 金属块消煮炉：要求温度保持在120～130℃之间，必要时可加继电器和接点温度计控制。金属块内消煮管的受热深度应高于或等于25mL消煮液的液面高度。

6.11 水浴

7 试样制备

采集具代表性的配合（混合）饲料或单一饲料，按四分法缩分制备实验室样品，取10～20g粉碎，使其全部通过样品筛（6.2）。充分混匀，装入密闭容器。

8 分析步骤

8.1 A法

8.1.1 总赖氨酸

8.1.1.1 酸水解

称取约含50mg粗蛋白质的样品两份，置于500mL烧瓶（6.5）中，加入250mL盐酸（5.4），装好回流冷凝器，置120～130℃油浴（6.4）中，使其徐徐沸腾，回流水解24h。

取下烧瓶，冷却。必要时将酸解液（连同水解后不溶物）重新定容至250mL。过滤，吸取5mL滤液，于旋转蒸发器（6.7）上，60℃左右蒸发至干。加水少许，重复蒸干1～2次。

将残渣溶于5mL稀释用柠檬酸钠缓冲液（5.6），离心10min（4000r/min），取上清液上机或贮于具塞小管中冷藏备用。

8.1.1.2 测定

打开氨基酸自动分析仪（6.8），使柱温，反应浴温度，缓冲液及茚三酮流速等各种操作参数达到预定要求，并按仪器说明书取一定量的赖氨酸标准液（5.9）进行校准。然后在同样条件下取8.1.1.1中所得之样品溶液进行测定。

8.1.2 非有效赖氨酸

8.1.2.1 二硝基苯化反应

称取约含50mg粗蛋白的样品两份，置于150mL烧瓶（6.5）中，加入4mL碳酸氢钠溶液（5.2），放置10min，其间需不时振摇。再加入6mLDNFB乙醇溶液（5.3），加盖，振摇，注意勿使样品颗粒粘附于瓶壁上。在室温下暗处放置过夜。

8.1.2.2 纯化

在旋转蒸发器上，温度不高于40℃条件下，将上述反应物蒸干，加入35mL乙醚（5.1），振摇或搅拌后，待固体充分沉降，弃去绝大部分乙醚，小心不要带出固体样品颗粒。重复上述操作两次，每次加25mL乙醚（此步骤乙醚层有时似较浑浊，只要倾倒时不带出样口颗粒，可不必离心）。最后，蒸发除去残存乙醚。

8.1.2.3 酸水解

边冲洗瓶口瓶壁边加入75mL盐酸（5.4），使样品全部浸于酸中，装好回流冷凝器，置于120～130℃油浴中，使其徐徐沸腾，回流水解24h。

取下烧瓶，冷却。将水解物定量转移至100mL容量瓶中，用水定容，过滤。吸取5mL滤液于旋转蒸发器上，60℃左右蒸发至干，加水少许，重复蒸干1～2次。

将残渣溶于3mL稀释用柠檬酸钠缓冲液（5.6），用离心机（6.6）离心10min，取上清液上机或贮于具塞小管中冷藏备用。

8.1.2.4 测定

同8.1.1.2。

非有效赖氨酸峰值较低，易受邻峰或杂峰干扰，如某些氨基酸自动分析仪该峰分离不好，需将树脂床（或分析柱）加长，或变换参数与程序。

8.2 B法──简化法

8.2.1 总赖氨酸

准确称取约含50mg粗蛋白质的样品双份，置于50mL水解管中，加入25mL

盐酸（5.4），装好回流冷凝器并置于预先热至120～130℃金属块消煮炉（6.10）上，缓缓煮沸水解24h。

 冷却，将水解液定容至50mL，混匀，过滤。吸取滤液2mL，于旋转蒸发器，60℃浓缩至干，加水少许，重复蒸干1～2次。

残渣中加入适量稀释用柠檬酸钠缓冲液（5.6），（粗蛋白质含量为10％～20％的样品加2mL，粗蛋白质含量为30％～50％的加5mL），充分溶解后离心，取上清液上机。

8.2.2 非有效赖氨酸

8.2.2.1 二硝基苯化反应

称取约含蛋白质20～25mg的样品双份，置于50mL水解管中，加入2mL碳酸氢钠溶液（5.2），放置10min（其间不时振摇），加入DNFB乙醇溶液（5.3）3mL，振摇混匀后，在室温下暗处放置过夜。

将上述水解管置85～90℃水浴中蒸去乙醇，直至振摇时不产生泡沫为止。此时水解管内物应失重2.5～3g。

8.2.2.2 纯化

于去醇后的水解管内加入2mL乙醚（5.1），加塞，剧烈振摇后令其分层，弃去乙醚层，再用乙醚萃取两次，每次10mL，弃去醚层后，将水解管放入60～70℃水浴，除去残存乙醚。

8.2.2.3 酸水解

边冲洗管口管壁边加入23mL盐酸（5.5）装好冷凝器，与测总赖氨酸样品一道置120～130℃金属块消煮炉（6.10）上，回流水解24h。

冷却，将水解液定容至50mL，混匀，过滤。吸取滤液5mL于60℃旋转蒸发器上蒸发至干，加水少许，重复蒸干1～2次。

残渣中加入适量稀释用柠檬酸钠缓冲液（5.6）（蛋白质含量10％～20％加3mL，30％～50％加5mL），充分溶解后离心，取上清液上机。

9 分析结果的表述

9.1 总赖氨酸

样品中总赖氨酸含量W1，以其质量百分率表示，即：

………………………………（1）

式中：A── 每毫升上机液中赖氨酸含量，ng；

m1── 样品质量，mg；

D── 稀释倍数。

9.2 非有效赖氨酸

样品中非有效赖氨酸含量W2，以其质量百分率表示，即：

………………………………（2）

式中：A── 每毫升上机液中赖氨酸含量，ng；

m2── 非有效赖氨酸测定中样品质量，mg；

D── 稀释倍数。

9.3 有效赖氨酸

样品中有效赖氨酸含量W3，以质量百分率表示，即：

有效赖氨酸W3＝W1－W2……………………………………（3）

若有效赖氨酸含量以其在总赖氨酸中的质量百分率表示，则

W3（％）＝〔（W1－W2）/W1〕×100……………………（4）

10 重复性

同一试样两平行测定值的相对相差，应不超过其平均值的10％。

注：与生物测定法相比，本法测定结果偏高，在分析评价实验结果时需加以注意。